Le ministre de l'économie, des finances et de l'industrie,
Vu la directive 98/34/CE du Parlement européen et du Conseil du 22 juin 1998 prévoyant une procédure d'information dans le domaine des normes et réglementations techniques ;
Vu le code de la consommation, notamment ses articles R. 215-19 et R. 551-1 ;
Vu l'avis de la commission générale d'unification des méthodes d'analyse ;
Vu la lettre parvenue le 1er octobre 1998 à la Commission de Communautés européennes par laquelle le Gouvernement a saisi ladite commission,
Arrête :

Art. 1er. - Les laboratoires chargés de concourir à l'application de la réglementation relative à la répression des fraudes sont tenus d'employer, pour effectuer le dosage des vitamines B 1, B 2 et B 6 dans les denrées et boissons destinées à l'homme, les méthodes décrites aux annexes au présent arrêté.

Art. 2. - L'arrêté du 21 octobre 1987 relatif aux méthodes officielles de dosage des vitamines B 1 et B 2 dans les produits diététiques et de régime est abrogé.

Art. 3. - Le directeur général de la concurrence, de la consommation et de la répression des fraudes est chargé de l'exécution du présent arrêté, qui sera publié au Journal officiel de la République française.

Fait à Paris, le 12 janvier 1999.

Pour le ministre et par délégation :
Le directeur général de la concurrence,
de la consommation
et de la répression des fraudes,
J. Gallot


A N N E X E I
METHODE OFFICIELLE DE DOSAGE DE LA VITAMINE B 1 (THIAMINE) DANS LES DENREES ET BOISSONS DESTINEES A L'HOMME
1. Domaine d'application
Cette méthode permet la détermination de la teneur en vitamine B 1 dans les denrées et boissons destinées à l'homme.
Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est toujours supérieur à 90 %, quel que soit l'aliment analysé, sauf pour les aliments contenant du chocolat. Lorsque le taux moyen de recouvrement est inférieur à 90 %, le déterminer pour chaque analyse et rendre un résultat corrigé.
2. Définition
La teneur en vitamine B 1 est le résultat, exprimé en mg/100 g, mg/100 ml ou mg/l de produit tel quel, obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Conventionnellement, ce résultat est exprimé en thiamine base.
3. Principe
Extraction de la vitamine B 1 (thiamine) par hydrolyses acide et enzymatique, puis oxydation de la thiamine en thiochrome par le ferricyanure de potassium. Dosage du thiochrome par fluorimétrie après isolement de ce composé par chromatographie liquide haute performance en phase inverse.
4. Réactifs
Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
4.1. Solution d'acide chlorhydrique à environ 0,1 mol/l.
4.2. Solution d'acétate de sodium à 2,5 mol/l.
4.3. -amylase.
4.4. Takadiastase.
4.5. Solution à 1 % (m/v) de ferricyanure de potassium (conservation une semaine à + 4 oC).
4.6. Solution à 15 % (m/v) d'hydroxyde de sodium.
4.7. Solution oxydante (à préparer extemporanément) : ajouter 1 ml de la solution de ferricyanure de potassium (4.5) à 24 ml de la solution d'hydroxyde de sodium (4.6).
4.8. Méthanol (qualité pour chromatographie).
4.9. Solution d'acétate de sodium à 0,05 mol/l.
4.10. Solution éluante : mélange 70:30 (v/v) de méthanol (4.8) et d'eau distillée.
4.11. Chlorhydrate de thiamine (PM = 337,3) C[[!]]1[[!]]2 H[[!]]1[[!]]8 Cl[[!]]2 N[[!]]4 OS.
4.12. Solution contenant 1 g/l de vitamine B 1 (thiamine base ; PM = 300,8) dans de l'eau distillée.
5. Appareillage
Toutes les opérations analytiques doivent être réalisées avec de la verrerie brune ou, à défaut, à l'abri de la lumière solaire directe.
5.1. Mixeur-broyeur.
5.2. Bain d'eau.
5.3. pH-mètre.
5.4. Etuve à 37 3 oC.
5.5. Cartouche Sep Pak C18 Société Waters.
ou équivalent.
5.6. Membrane d'acétate de cellulose 0,45 micro m.
5.7. Appareil de chromatographie liquide haute performance avec détection par fluorimétrie.
5.8. Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilane (5 micro m) (longueur de 15 à 30 cm et diamètre intérieur 4 mm) ou une phase inverse greffée de type octylsilane (5 micro m) (longueur de 15 à 30 cm et diamètre intérieur 4 mm), traitée pour la séparation des composés basiques.
6. Mode opératoire
6.1. Préparation de l'échantillon pour essai.
Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement (si nécessaire). Peser exactement environ M grammes (ou millilitres) de cet échantillon dans un erlenmeyer de 250 ml (M de l'ordre de 5 grammes pour un échantillon contenant approximativement 0,8 mg/100 g de vitamine B 1). Ajouter 65 ml de la solution d'acide chlorhydrique 0,1 mol/l (4.1) et mettre au bain d'eau à 100 oC pendant 30 minutes. Refroidir et ajuster à pH 4,5 par addition de solution d'acétate de sodium (4.2). Ajouter ensuite 50 mg de -amylase et 500 mg de takadiastase et agiter. Mettre à l'étuve à 37 oC pendant une nuit. Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 125 ml et ajuster avec de l'eau distillée. Filtrer le surnageant. (Si la filtration est longue, il est possible de refaire l'analyse en utilisant pour l'hydrolyse une solution d'acide chlorhydrique 0,5 mol/l.)
Mettre 1 ml du filtrat obtenu dans un bécher de 15 ml. Ajouter 3 ml de la solution oxydante (4.7). Agiter puis laisser au repos 1 minute exactement. Faire passer cette solution ainsi que les eaux de lavage sur une cartouche Sep Pak C18 (conditionnée par passage de 2 ml de méthanol 4.8 et 5 ml d'eau). Laver la cartouche avec 10 ml de solution d'acétate de sodium (4.9) puis éluer avec 8 ml de la solution (4.10). Compléter à 10 ml avec cette même solution et filtrer si besoin sur membrane d'acétate de cellulose (5.6) (solution échantillon à injecter dans le chromatographe).
6.2. Préparation des témoins.
Faire une dilution au 1/100 avec de l'eau distillée à partir de la solution mère (4.12). Puis faire trois dilutions au 1/50, 1/25 et 1/10 à partir de la solution précédente. Prélever exactement 1 ml de chaque solution obtenue et les introduire dans des béchers de 15 ml. Ajouter dans chaque bécher 3 ml de la solution oxydante (4.7). Agiter, puis laisser au repos 1 minute. Faire passer ces solutions, ainsi que les eaux de lavage sur des cartouches Sep Pak C18 conditionnées par passage de 2 ml de méthanol (4.8) et 5 ml d'eau distillée. Laver les cartouches avec 10 ml de solution d'acétate de sodium (4.9) puis éluer avec 8 ml de la solution (4.10). Compléter à 10 ml avec cette même solution et filtrer chaque solution témoin sur une membrane d'acétate de cellulose (5.6) (solutions témoins contenant respectivement 0,020 micro g/ml, 0,040 micro g/ml et 0,100 micro g/ml de thiamine à injecter dans le chromatographe).
6.3. Conditions chromatographiques :
- phase mobile : mélange 30/70 (v/v) de méthanol (4.8) et de solution d'acétate de sodium (4.9) (ces proportions peuvent éventuellement être modifiées si nécessaire) ;
- débit de la phase mobile : 0,7 à 1 ml par minute ;
- détection par fluorescence : longueur d'onde d'excitation : 366 nm ; longueur d'onde d'émission : 435 nm ;
- volume injecté : 20 micro l à 100 micro l.
6.4. Taux de recouvrement.
Pour l'aliment étudié, peser exactement deux séries de deux échantillons. Analyser selon le mode opératoire (6.1) les deux échantillons de la première série (échantillons 1 et 2). Dans les deux échantillons de la deuxième série (échantillons 3 et 4), ajouter une certaine quantité de thiamine avant de procéder à l'hydrolyse acide, puis procéder à l'analyse selon (6.1). Le taux de recouvrement moyen de la méthode (t) est donné par la relation :
t = 2 (x[[!]]3 + x[[!]]4) - (x[[!]]1/M[[!]]1 + x[[!]]2/M[[!]]2) (M[[!]]3 + M[[!]]4)
4z
dans laquelle :
M[[!]]1, M[[!]]2, M[[!]]3 et M[[!]]4 sont les masses (en g) des prises d'essai des différents échantillons, x[[!]]1, x[[!]]2, x[[!]]3 et x[[!]]4 sont les quantités de vitamine, exprimées en micro g/ml de thiamine, dans les différentes solutions injectées,
et z est la quantité de thiamine ajoutée (en micro g/ml) présente dans les solutions injectées pour les échantillons 3 et 4.
Nota. - Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est toujours supérieur à 90 %, quel que soit l'aliment analysé, sauf pour les aliments contenant du chocolat. Dans ce dernier cas, le taux de recouvrement est beaucoup plus faible et doit être déterminé pour chaque analyse.
7. Expression des résultats
7.1. Mode de calcul et formule.
Soit x la quantité de vitamine B 1 (thiamine base) exprimée en mg contenue dans 1 ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à l'aide de la courbe d'étalonnage) et M la prise d'essai (en g ou en ml). La teneur en vitamine de l'échantillon à analyser exprimée en mg de thiamine base pour 100 g (ou 100 ml) est donnée par la relation :
125 x
M
7.2. Fidélité.
Dix laboratoires ont participé à un essai interlaboratoire organisé par la commission générale d'unification des méthodes d'analyses. Les résultats statistiques présentés dans le tableau en annexe ont été déterminés selon la norme NF ISO 5725.
7.2.1. Répétabilité.
La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels et indépendants, obtenus dans le même laboratoire, par le même opérateur utilisant le même appareillage et dans un court intervalle de temps, ne doit pas être supérieure aux valeurs de répétabilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques en annexe.
7.2.2. Reproductibilité.
La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus dans des laboratoires différents, par des opérateurs différents, utilisant des appareillages différents, ne doit pas être supérieure aux valeurs de reproductibilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques suivant.
8. Résultats statistiques de l'essai interlaboratoire